多聚半乳糖醛酸酶(PG)/果膠酶試劑盒微板法

多聚半乳糖醛酸酶(PG)/果膠酶試劑盒微板法

多聚半乳糖醛酸酶(PG)/果膠酶試劑盒微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 多聚半乳糖醛酸酶（ploygalacturonase，PG）試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS1070W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 果膠酶是指分解果膠的多種酶，主要包括多聚半乳糖醛酸酶(PG),果膠裂解酶(PL),果膠 甲酯酶(PME)和原果膠酶，貯藏過(guò)程中起作用的主要是 PG。所以該酶在食品貯藏保鮮和 植物抗病性等領(lǐng)域具有較高的研究?jī)r(jià)值。 果膠在多聚半乳糖醛酸酶(PG)作用下，能水解產(chǎn)生帶有具有還原性醛基的半乳糖醛酸。 與 DNS 試劑反應(yīng)生成紅棕色物質(zhì)，在 540nm 有特征吸收峰，測(cè)定 540nm 處吸光值變化 可計(jì)算得多聚半乳糖醛酸酶活性。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 120mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 14mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 液體 14mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、臺(tái)式離心機(jī)、天平、可調(diào)式移液器、恒溫水浴鍋、研缽、冰。 四、多聚半乳糖醛酸酶(PG)的測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.2g 組織（水分充足的樣本可取 1g），加入 1mL 經(jīng)預(yù)冷的 95%乙醇冰浴勻 漿，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀，向沉淀中加入經(jīng)預(yù) 冷的 80%乙醇混勻，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀。再 向沉淀中加入 1mL 經(jīng)預(yù)冷提取液，渦旋混勻，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 10min；留上清，棄沉淀。上清液置冰上待測(cè)。 ② 細(xì)菌/培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或 細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s， 間隔 10s，重復(fù) 30 次）；12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為 500：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：直接檢測(cè)。若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 540nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 樣本 20 20 試劑一 130 試劑二 130 40℃水浴 30min本試劑盒僅供科研使用 2 【注】若△A 在零附近徘徊，可增加樣本上樣量 V1（如增加至 50μL，則試劑一或二相應(yīng)減少）， 或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 T（如增至 1h），則改變后的 V1 和 T 需代入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 18.053x - 0.0263：x 為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量，mg；y 為△A。 2、按照蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：在 40℃，每毫克蛋白每小時(shí)分解果膠酸產(chǎn)生 1mg 半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。 PG 活性(mg/h/mg prot)=[(ΔA+0.0263)÷18.053]÷(V1×Cpr)÷T=5.54×(ΔA+0.0263)÷Cpr 3、按照樣本質(zhì)量計(jì)算： 酶活定義：在 40℃，每克樣本每小時(shí)分解果膠酸產(chǎn)生 1mg 半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位（U）。 PG 活性(mg/h/g 鮮重)=[(ΔA+0.0263)÷18.053]÷(V1÷V×W)÷T=5.54×(ΔA+0.0263)÷W 4、按細(xì)菌/細(xì)胞密度計(jì)算： 酶活定義：在 40℃，每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每小時(shí)分解果膠酸產(chǎn)生 1mg 半乳糖醛酸為一個(gè)酶 活力單位（U）。 PG 活性(mg/h/104 cell)=[(ΔA+0.0263)÷18.053]÷(V1÷V×500)÷T=0.011×(ΔA+0.0263) 5、按液體體積計(jì)算： 酶活定義：在 40℃，每毫升液體每小時(shí)分解果膠酸產(chǎn)生 1mg 半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位 PG 活性(mg/h/mL)=[(ΔA+0.0263)÷18.053]÷V1÷T=5.54×(ΔA+0.0263) V---加入提取液體積，1mL； V1---反應(yīng)中樣本體積，0.02mL； W---樣本質(zhì)量，g； T---反應(yīng)時(shí)間，0.5h; 500---細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)； Cpr---樣本蛋白濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過(guò)程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液(10mg/mL)：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1mL 的蒸餾水（母液需在兩 天內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成五個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0，1，2，3，4，5.mg/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣 本來(lái)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)測(cè)定管的加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 試劑三 150 150 沸水浴（95-100℃）5min，冰浴或淋浴冷卻后，取 200μL 于 96 孔板中，540nm 處測(cè)定吸光值 A，△A=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管（每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管）。