海藻糖含量試劑盒(蒽酮比色法)

海藻糖含量試劑盒(蒽酮比色法)

海藻糖含量試劑盒(蒽酮比色法)

本試劑盒僅供科研使用 1 海藻糖含量試劑盒（蒽酮比色法）說明書 （貨號：WS2550F 分光法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 海藻糖(trehalose)是一種非還原性雙糖，廣泛存在于動植物、微生物和培養(yǎng)細胞中。具有 在干燥、干旱、冷凍、高滲透壓等惡劣環(huán)境下保護核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的作用，被 廣泛用于醫(yī)藥、保健品、酶、食品等制品的保存。 本試劑盒用蒽酮-硫酸法測定海藻糖含量，利用糖類在較高溫度下可被濃硫酸作用而脫 水生成糠醛或羥甲基糖醛后，與蒽酮脫水縮合，形成糠醛的衍生物，呈藍綠色。該物質(zhì)在 620 nm 處有吸收，其顏色的深淺與糖含量成正比。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 120mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉體 mg×3 瓶 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部，每瓶 加 11mL 的濃硫酸溶解備用。剩余 試劑 4℃保存一周。 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、濃 硫酸和蒸餾水。 四、海藻糖含量測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織放入研缽中，加入 1mL 提取液進行研磨成勻漿，室溫晃動提取 30min，8000rpm 室溫（25℃）離心 10min，取上清。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取 ② 細菌/真菌樣本： 先收集細菌或真菌到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬細菌或真菌加入 1mL 提取 液；冰浴超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次），室溫晃動提取 30min， 8000rpm 室溫（25℃）離心 10min，取上清。 【注】：若增加樣本量，可按照提取液體積(mL) ：細菌或真菌數(shù)量（104 個）為 1：500~1000 的比例提取 ③ 液體樣本： 取 0.1mL 液體加入 1mL 提取液渦旋混勻，室溫晃動提取 30min， 8000rpm 室溫（25℃） 離心 10min，取上清。 【注】：若增加樣本量，可按照液體體積（mL）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取。 2、上機檢測： ① 可見分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 620nm，蒸餾水調(diào)零。 ② 調(diào)節(jié)水浴鍋至 95 度。 ③ 先調(diào)2-3個樣本做預(yù)測定，若吸光值A大于1.5，將樣本用提取液稀釋后（5-20倍）再 測定，計算公式中乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)D。 ④ 在 EP 管中依次加入：本試劑盒僅供科研使用 2 試劑名稱（μL） 測定管 空白管 樣本 300 蒸餾水 300 試劑一 600 600 95-100℃沸水浴 3min，冷卻后，混勻，全部液體轉(zhuǎn)移至 1mL 玻璃比色 皿（光徑 1cm）中，于 620nm 處讀取吸光值 A，ΔA=A 測定-A 空白。 五、結(jié)果計算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y = 52.321x - 0.0388；x 為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（mg），y 為吸光值 A。 2、按樣本鮮重計算： 海藻糖含量(μg/g 鮮重)=[(ΔA+0.0388)÷52.321×103]÷(W×V1÷V)×D =63.71×(ΔA+0.0388)÷W×D 3、按細菌或真菌密度計算： 海藻糖含量(μg/104cell)=[(ΔA+0.0388)÷52.321×103]÷(500×V1÷V)×D =0.127×(ΔA+0.0388)×D 4、液體中海藻糖含量計算： 海藻糖含量(μg/mL)=[(ΔA+0.0388)÷52.321×103]÷(V2×V1÷(V+V2)×D =700.8×(ΔA+0.0388)×D V---提取液總體積 1mL； V1---反應(yīng)體系中樣本體積，300μL=0.3mL； V2---液體體積，0.1mL； W---樣本質(zhì)量，g； D---稀釋倍數(shù)，未稀釋即為 1； 500---細菌或真菌總數(shù)，500 萬。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1mg/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 2mL 提取液（母液需在兩天 內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液用提取液稀釋成六個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1.mg/mL。 也可根據(jù)實際樣本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)測定管的加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。