Super Fluor 488

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一．實(shí)驗(yàn)步驟

1.1 蛋白溶解：用0.1 M NaHCO3 溶解至終濃度為2mg/mL 

將1mL 去離子水加入84mg NaHCO3 瓶中，配成1M 的碳酸氫鈉溶液。振蕩或吹打至*溶解。該溶液pH 約8.3，2～6℃保存可用2個(gè)星期；若抗體是溶液，將抗體稀釋至2mg/mL，再加入1/10 體積的上述碳酸氫鈉溶液；若抗體是凍干粉，將1M 碳酸氫鈉溶液用10 倍去離子水稀釋成0.1M 后，用其將抗體溶成2mg/mL 的溶液。

1.2 染料溶解：染料固體粉末從冰箱放入干燥器中慢慢升至常溫后，用無(wú)水DMSO將染料配置濃度為1 mg/mL。

1.3 標(biāo)記：在1mL蛋白溶液中緩慢加入適量染料溶液，（蛋白:染料摩爾比=1:20～50；質(zhì)量比可在以下范圍內(nèi)優(yōu)化 10～200ug Super dye每毫克IgG抗體）。同時(shí)在暗處常溫緩慢攪拌1小時(shí)。也可以直接將蛋白溶液直接加入染料的固體粉末的試劑瓶中，同時(shí)在暗處常溫緩慢攪拌1小時(shí)。

1.4 純化：選擇下面三種方式純化后，產(chǎn)品冷凍干燥成粉末或在0.01 M PBS/2mM 溶液中，-20℃避光儲(chǔ)存。

1.4.1 透析法：

1）簡(jiǎn)單純化可用100 mL 0.15 M NaCl 溶液常溫避光透析4次,每次4小時(shí)除去未標(biāo)記上的染料。 

2）在4°C用新鮮的1 L 0.15 M NaCl 溶液再避光透析過(guò)夜。  

3）用100 mL 0.01 M PBS/ 0.01% 溶液常溫避光透析4小時(shí), 在4°C常溫避光再次透析過(guò)夜。 

4）用0.22 μm注射器過(guò)濾頭過(guò)濾抗體溶液。

1.4.2 P-30柱子

1）0.5g p-30凝膠加入9mLPBS（pH=7.4）室溫過(guò)夜放置；次日，棄上清；真空抽濾5min。

2）加入9mLPBS，輕柔震蕩均勻，放置20min后，去除上清液。

3）再重復(fù)2）。

4）將樹(shù)脂柱放入一個(gè)13×100mm 的玻璃管柱中，每個(gè)柱子加入1.5mL（不要多加），填的要均勻不能有氣泡。具體方法是：攪動(dòng)純化樹(shù)脂（組分C），加入1.0mL 懸浮液至空柱中靜置；全部下沉后再加入0.5mL樹(shù)脂至床體積為～1.5mL蓋上蓋子，可以室溫保存。

5) 將樹(shù)脂柱上下端的口打開(kāi)，放入10mL離心管中由于重力水自然流下，用垂直轉(zhuǎn)子1100g 離心3min，rpm 與相對(duì)離心力g 的換算公式如下：相對(duì)離心力g=(1.12×10-5)(rpm)2(半徑cm)；離心后靜置待緩沖液全部流出，棄去緩沖液，保留收集管（若沒(méi)有垂直轉(zhuǎn)子，角轉(zhuǎn)子也可）。

6) 換上干凈的離心管，將標(biāo)記的蛋白反應(yīng)液200μL逐滴加入樹(shù)脂柱的中心部位，使溶液被吸入膠床中；

7) 將樹(shù)脂柱放入空的收集管中，1100g 離心5min；

8）離心后，收集管內(nèi)是標(biāo)記好的蛋白，溶在100μLPBS 中，pH7.2，包括2mM 的疊氮鈉。未結(jié)合的染料保留在柱中，棄去樹(shù)脂柱。

注意事項(xiàng)：配置柱子時(shí)，用較細(xì)的小瓶，每個(gè)小瓶配置2個(gè)柱子。便于去除水分。填柱子時(shí)，加到1.5mL，盡量不要多加，離心時(shí)間按照說(shuō)明書(shū)1000g/3min，不要隨便更改。