葉綠體 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)試劑盒

葉綠體 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 葉綠體 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)試劑盒說明書 （貨號(hào)：WS2160F 分光法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 葉綠體 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)是卡爾文循環(huán)中的關(guān)鍵酶，催化 3-磷酸甘油酸和 ATP 反應(yīng)產(chǎn)生 1,3-二磷酸甘油酸，后者在 3-磷酸甘油醛脫氫酶和 NADH 作用下產(chǎn)生 3-磷酸甘 油醛和 NAD+，通過測(cè)定 NADH 的下降量，進(jìn)而得到 3-磷酸甘油酸激酶的活性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液一 液體 50mL×1 瓶 4℃保存 提取液二 液體 50mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部，再加 2.2mL 蒸餾水溶解備用。 試劑二 粉劑 mg×3 支 4℃保存 用前取一支甩幾下或離心使試劑 落入底部，再加 0.4mL 蒸餾水溶解 備用。 試劑三 液體μL×1 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部，再加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 試劑四 液體 35mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部，再加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 三、所需的儀器和用品： 紫外分光光度計(jì)、1mL 石英比色皿（光徑 1cm）、可調(diào)式移液器、天平、震蕩儀、低 溫離心機(jī)、研缽。 三、葉綠體 3-磷酸甘油酸激酶（PGK）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： 稱取約 0.1g 植物組織樣本，加入 1mL 提取液一，快速冰浴勻漿后于 4℃，1600rpm 離 心 5min，棄沉淀，取上清再 4℃，5000rpm 離心 15min，棄上清留沉淀，向沉淀中加 1mL 提取液二，強(qiáng)力渦旋震蕩 15s，置于冰上(或冰箱)在 4℃孵育 15min，4℃，13000rpm 離心 5min，取上清測(cè)定葉綠體中 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)的酶活性。提示：整個(gè)葉綠體的提取 過程須保持 4℃低溫環(huán)境。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 紫外分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，設(shè)定溫度 25℃，蒸餾水調(diào)零。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ③ 在 1mL 石英比色皿中依次加入：本試劑盒僅供科研使用 2 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 樣本 80 試劑一 40 試劑二 20 試劑三 20 試劑四 600 混勻，室溫（25℃）條件下，孵育 10min 試劑五 20 輕輕混勻，室溫（25℃）條件下，30s 時(shí)于 340nm 處讀取吸光值 A1，10min 后再讀取 A2， ΔA=A1-A2。 【注】1.若△A 的值在零附近，可以適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到 20min 后讀取 A2，改變后的反應(yīng)時(shí)間 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。或適當(dāng)加大樣本量(如 100μL，則試劑四相應(yīng)減少)，則改變 后的加樣體積需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 2. 若下降趨勢(shì)不穩(wěn)定，可以每隔 20S 讀取一次吸光值，選取一段線性下降的時(shí)間段來(lái)參與 計(jì)算，相對(duì)應(yīng)的 A 值也代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 3. 若起始值 A1 太大如超過 2（如顏色較深的植物葉片，一般色素較高，則起始值相對(duì)會(huì) 偏高），可以適當(dāng)減少樣本加樣量，則改變后的加樣體積需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 或向待測(cè)樣本中加少許活性炭混勻靜置 5min 后 12000rpm, 4℃離心 10min，上清液用于 檢測(cè)； 4. 若ΔA 的值大于 0.5，則需減少反應(yīng)時(shí)間（如減少至 5min），或減少樣本量（如 20μL）， 則改變后的反應(yīng)時(shí)間 T 和樣本量 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按照樣本質(zhì)量計(jì)算 酶活定義：每克組織每分消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 NADH-GPK（nmol/min/g 鮮重）= [ ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(W×V1÷V) ÷T=156.8×ΔA÷W 2、按樣本蛋白濃度計(jì)算 單位定義：每毫克組織蛋白在每分鐘內(nèi)氧化 1nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 NADH-GPK（nmol/min/mg prot）= [ ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(V1×Cpr) ÷T=156.8×ΔA÷Cpr ε---NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm； d---比色皿光徑，1cm； V---加入提取液體積，1mL； V1---加入樣本體積，0.08mL； V2---反應(yīng)體系總體積，0.78mL=7.8×10-4L； T---反應(yīng)時(shí)間，10min； W---樣本質(zhì)量，g。