焦磷酸：果糖6磷酸1磷酸轉(zhuǎn)移酶試劑盒微板法

焦磷酸：果糖6磷酸1磷酸轉(zhuǎn)移酶試劑盒微板法

焦磷酸：果糖6磷酸1磷酸轉(zhuǎn)移酶試劑盒微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶（Pyrophosphate: fructose-6 – phosphate-1-phosphoric acid transferase，PFP）試劑盒說明書 （貨號：WS7060W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶（PFP，EC2.7.1.90）是一種胞質(zhì)酶，廣泛存在于 植物組織中，催化果糖-6-磷酸與果糖-1,6-二磷酸之間的可逆轉(zhuǎn)化，在光合作用碳代謝 中起重要作用。 PFP 催化 6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為 1,6-二磷酸果糖，接著在醛縮酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶的作 用下轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿岫u丙酮，再由 3-磷酸甘油脫氫酶催化，并使 NADH 在 340nm 處的吸 光度下降，由此反映 PFP 酶活性高低。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 120mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×2 支 -20℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部，每 支再加 3.1mL 的蒸餾水溶解，用 不完的試劑分裝后-20℃保存，禁 止反復(fù)凍融，三天內(nèi)用完。 試劑二 液體μL×1 瓶 -20℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部，再 加 6.1mL 的蒸餾水溶解 試劑三 液體 2.2mL×1 瓶 4℃保存 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、低溫離心機、可調(diào)式移液器、移液槍、研缽、冰和蒸餾水。 四、焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶（PFP）酶活測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實 驗樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿。12000rpm，4℃離心 20min， 取上清置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取 2、上機檢測： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長到 340nm。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ③ 依次在 96 孔板中加入： 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 20 提取液 60 試劑一 60 試劑二 60 試劑三 20 混勻，室溫（25℃）條件下，10s 時于 340nm 處讀取吸光值 A1，20min 后讀取 吸光值 A2，△A=A1-A2。 【注】1.若△A 的值在零附近，可以適當(dāng)延長反應(yīng)時間到 30min 或更長讀取 A2，改變后的反本試劑盒僅供科研使用 2 應(yīng)時間需代入計算公式重新計算。或適當(dāng)加大樣本量，則改變后的加樣體積 V1 需代 入計算公式重新計算。 2. 若起始值 A1 太大如超過 2（如顏色較深的植物葉片，一般色素較高，則起始值相對 會偏高），可以適當(dāng)減少樣本加樣量，則改變后的加樣體積需代入計算公式重新計算。 或向待測樣本中加少許活性炭混勻靜置 5min 后 12000rpm, 4℃離心 10min，上清液 用于檢測； 3. 若ΔA 的值大于 0.5，則需減少反應(yīng)時間（如減少至 5min），則改變后的反應(yīng)時間 T 需代入計算公式重新計算。 4. 若下降趨勢不穩(wěn)定，可以每隔 10S 讀取一次吸光值，選取一段線性下降的時間段來 參與計算，相對應(yīng)的 A 值也代入計算公式重新計算。 五、結(jié)果計算： 1、按照樣本蛋白濃度計算 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。 PFP（nmol/min/mg prot）＝[ ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(Cpr×V1÷V) ÷T=160.77×ΔA÷Cpr 2、按照樣本質(zhì)量計算 酶活定義：每克組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。 PFP（nmol/min/g 鮮重）＝[ ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(W ×V1÷V) ÷T=160.77×ΔA÷W ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm； d：比色皿光徑，0.5cm； V：加入提取液體積，1mL； V1：加入樣本體積，0.02mL； V2：反應(yīng)體系總體積，0.2mL=2×10-4L； T：反應(yīng)時間，20 min； W：樣本質(zhì)量，g Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。