植物磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)試劑盒

植物磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)試劑盒

植物磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 植物磷酸丙糖異構(gòu)酶（Triose-phosphate isomerase，TPI）試劑盒說明書 （貨號：WS4060F 紫外分光法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 植物葉綠體中磷酸丙糖異構(gòu)酶（EC 5.3.1.1, TPI 或 TIM）是光合作用中參與 calvin 循環(huán) 的重要酶。磷酸二羥丙酮能快速透過葉綠體的包膜進入細胞質(zhì)，并在其中逐步轉(zhuǎn)化為蔗糖。 TPI 轉(zhuǎn)化磷酸二羥丙酮轉(zhuǎn)化為甘油醛 3-磷酸，接著與酶混合物作用，伴隨著 NADH 的生 成，通過檢測 NADH 在 340nm 處的增加速率，進而計算出 TPI 酶活性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液一 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 提取液二 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體μL×1 支 -20℃保存 用前先離心或甩幾下使試劑落入底 部，再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解。 試劑二 粉體 mg×1 支 -20℃保存 用前先離心或甩幾下使試劑落入底 部，再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解。 試劑三 液體:40mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 粉體 mg×1 支 -20℃保存 用前先離心或甩幾下使試劑落入底 部，再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解。 三、所需的儀器和用品： 紫外分光光度計、1mL 石英比色皿（光徑 1cm）、可調(diào)式移液器、天平、低溫離心機、 研缽、震蕩儀。 四、磷酸丙糖異構(gòu)酶（TPI）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實 驗樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 總TPI酶提?。?/span>建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液二進行冰浴勻漿，于4℃，13000rpm 離心5min，取上清液測定。 ② 胞漿和葉綠體 TPI 酶的分離： 稱取約0.2g樣本，加入1mL提取液一，冰浴勻漿后于4℃，1600rpm離心5min，棄沉淀， 取上清在4℃，5000rpm離心15min，取上清用于測定胞漿TPI酶活性，沉淀留用。 取上述沉淀加1mL提取液二，強力渦旋震蕩15s，置于冰上(或冰箱)孵育15min，在4℃， 13000rpm離心5min，取上清測定葉綠體中TPI酶活性。 【注】：a、測定總 TPI 酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中 的 TPI，則按照步驟②提取粗酶液。 b、整個葉綠體的提取過程須保持4℃低溫環(huán)境。 2、上機檢測： ① 紫外分光光度計預熱 30min，調(diào)節(jié)波長至 340nm，設定溫度 25℃，蒸餾水調(diào)零。 ② 所有試劑剛從冰箱里面拿出需先解凍至室溫（25℃）。本試劑盒僅供科研使用 2 ③ 在 1mL 石英比色皿中依次加入： 試劑名稱（μL） 樣本管 樣本 40 試劑一 20 試劑二 20 試劑三 600 試劑四 20 輕輕混勻，于 340nm 處檢測，10s 讀取 A1，10min 后讀取 A2，△A=A2-A1。 【注】 若△A 在零附近徘徊，可以延長反應時間 T（如 30min），或者加大樣本 量 V1（如增至 80μL，則試劑三相應減少），則改變后的反應時間 T 和樣本量 V1 代入計算公式重新計算。 五、結(jié)果計算： 1、按照樣本蛋白濃度計算 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。 TPI（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷（V1×Cpr）÷T = 281.4×ΔA÷Cpr 2、按照樣本質(zhì)量計算 酶活定義：每克組織每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。 TPI（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷（W ×V1÷V）÷T = 281.4×ΔA÷W V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.04mL； V2---反應體系總體積，7×10-4 L； d---光徑，1cm； ε---NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm； W---樣本質(zhì)量，g； T---反應時間，10min； Cpr---蛋白濃度（mg/mL），建議使用本公司的 BCA 蛋白含量測定試劑盒。