6-磷酸山li醇脫氫酶活性試劑盒,微板法

6-磷酸山li醇脫氫酶活性試劑盒,微板法

6-磷酸山li醇脫氫酶活性試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 6-磷酸山*醇脫氫酶(Sorbitol-6-phosphate dehydrogenase）活性試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS5750W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 6-磷酸山*醇脫氫酶（S6PDH，EC 1.1.1.200）又稱醛糖 6-磷酸還原酶（Aldose-6-phos -phate reductase，A6PR），催化 D-山梨糖醇 6-磷酸和 D-葡萄糖 6-磷酸之間的相互轉(zhuǎn)化。研 究發(fā)現(xiàn)該酶在蘋(píng)果葉片等薔薇科植物中廣泛分布，其在山*醇合成中起著重要作用。 6-磷酸山*醇脫氫酶（S6PDH）催化 D-葡萄糖 6-磷酸還原，并使還原型輔酶Ⅱ（NADPH） 氧化。因此，通過(guò)檢測(cè) 340nm 下 NADPH 的下降速率，即可得出 S6PDH 的酶活性大小。 該酶催化的反應(yīng)：D-sorbitol 6-phosphate+NADP+=D-glucose 6-phosphate+NADPH+H+ 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×2 支 4℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底部， 每支分別加 0.6mL 蒸餾水溶解備用。 用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止 反復(fù)凍融，三天內(nèi)用完。 試劑二 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 粉劑 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、冰。 四、6-磷酸山*醇脫氫酶（S6PDH）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： 稱取約 0.1g 組織樣本，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min， 取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ③ 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 樣本 10 試劑一 10 試劑二 170 混勻，室溫（25℃）下孵育 10min 試劑三 10 混勻，室溫（25℃）下，于 340nm 處讀取 A1， 10min 后讀取 A2。ΔA=A1-A2。 【注】 1.若 10s 后反應(yīng)體系未穩(wěn)定可延長(zhǎng)到 1min 再讀值。 2.若△A 在零附近，可適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 T 至 20min 或更長(zhǎng)讀取 A2，或適當(dāng)加大樣本量 V1本試劑盒僅供科研使用 2 （如增至 20μL，則試劑二相應(yīng)減少），則改變后的 T 和 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 4. 若起始值 A1 太大如超過(guò) 2（如顏色較深的植物葉片，一般色素較高，則起始值相對(duì)會(huì)偏 高），可以適當(dāng)減少樣本加樣量 V1，則改變后的 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 或向待測(cè)樣本中加少許活性炭混勻靜置 5min 后 12000rpm, 4℃離心 10min，上清液用于檢測(cè)； 5. 若ΔA 大于 0.25，需減少反應(yīng)時(shí)間 T（如減至 5min），則改變后的 T 需代入公式重新計(jì)算。 6. 若下降趨勢(shì)不穩(wěn)定，可以每隔 30S 讀取一次吸光值，選取一段線性下降的時(shí)間段來(lái)參與計(jì) 算，相對(duì)應(yīng)的 A 值也代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按樣本蛋白濃度計(jì)算 單位定義：每毫克組織蛋白在每分鐘內(nèi)氧化 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 S6PDH 活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr) ÷T =643.1×ΔA÷Cpr 2、按樣本鮮重計(jì)算 單位定義：每克組織在每分鐘內(nèi)氧化 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 S6PDH 活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T =643.1×ΔA÷W V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.01mL； V2---反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L； d---96 孔板光徑，0.5cm； ε---NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm； W---樣本質(zhì)量，g； T---反應(yīng)時(shí)間，10min； Cpr---蛋白濃度（mg/mL），建議使用本公司的 BCA 蛋白含量測(cè)定試劑盒。